抗病毒性心肌炎药

一、体外细胞培养：

1. 病毒：柯萨奇B组病毒B3型Nancy株，对小鼠心肌毒力强或其他标准毒株如B2Chio—1株，水疱性口炎病毒（VsV）。

2. 细胞：大鼠4天乳鼠心肌原代细胞，Vero细胞，L929细胞。

3. 阳性对照药物：盐酸胍。

4. 病毒毒力测定：Vero细胞，原代心肌细胞96孔板培养，以细胞病变或中性红，MTT染色法测TCID₅₀。

5. 药物毒性测定：在Vero细胞和心肌细胞96孔培养板中加入不同浓度药物，以细胞病变，中性红或MTT染色法测定TCD₀和TCID₅₀。

6. 抗病毒实验：

（1）细胞病变抑制实验：

Vero细胞20万/mL接种96孔板，0.1mL/孔。培养1-2天长成单层，感染病毒10-100TCID50，感染后不同时间，将待测药物和阳性对照药自最大无毒浓度开始稀释5个稀释度加入细胞，显微镜下观察，病毒对照近全部破坏时记录结果。设细胞对照，病毒对照，药物对照。

检测指标：染色法检测药物对细胞病变的抑制作用，计算IC50及T1，或用酶联免疫吸附法检测病毒。

（2）病毒在心肌细胞上病变发展慢，可在制备细胞同时感染病毒，不同时间加药，培养3天需换药液，检测指标同上

（3）病毒繁殖抑制实验：感染和加药后不同时间收集上述细胞，裂解后，上清作系列10倍稀释，在Vero细胞上以染色法检测病毒滴度，计算TCID₅₀。加药组比病毒对照组TCID₅₀降低1个对数以上作为有效。

（4）药物在Balb/c小鼠脾细胞上诱生干扰素，在L₉₂₉细胞上以VSV测定干扰素效价。

二、体内动物实验：

1. 病毒：柯萨奇B组病毒B3型Nancy株，对小鼠心肌毒力强或其他标准毒株如B2Chio-1株，水疱性口炎病毒（VsV）。

2. 动物：NIH， Balb/C雄性断乳小鼠。

3. 阳性对照药：缺少肯定阳性对照药。

4. 病毒毒力测定：小鼠腹腔感染系列10倍稀释病毒，观察2周，计算LD50。

5. 药物毒性测定：小鼠口服，注射药物测LD_O 、LD₅₀。

6. 抗柯萨奇病毒体内药效试验：

100 LD₅₀病毒0.3ml经腹腔感染小鼠，感染后不同时间将待测药物稀释至1/3 LD₅₀开始3-4个剂量给药，观察：

A.死亡数。与病毒对照组比较死亡保获率，延长生命率，以x， t值计算差别。

B.感染后不同日期取血，分离血清，在Vero细胞上检查病毒滴度，计算TCID₅₀，给药组比病毒对照组降低一个对数以C.上为有抑制。血清需检测乳酸脱氢酶（LDH）单位，以t值计算抑制有无显著性。

C.感染给药后不同时间取血，分离血清，在Vero细胞上检查中和抗体，在L₉₂₉细胞上检查干扰素产生动态。