对化学性肝损伤有辅助保护功能动物试验评价方法

1.有助于降低化学性肝损伤危害功能

动物实验分为方案一（刀豆蛋白A急性肝损伤模型）、方案二（酒精性肝损伤模型），其中方案二又分为急性酒精性肝损伤模型和亚急性酒精性肝损伤模型两种。

2.方案一：刀豆蛋白A急性肝损伤模型

2.1 原理

    刀豆蛋白A是一种在人体内对肝细胞有特异性毒性作用的植物凝集素，它能在体外激活T细胞的丝裂原，进入循环后首先活化T淋巴细胞，继而激活肿瘤坏死因子（TNF）和白介素2等细胞因子，引发炎症反应，可诱导淋巴细胞、巨噬细胞的细胞毒作用，通过肝细胞凋亡等多种途径损伤肝细胞。

2.2 动物试验方法

成年大鼠或小鼠，单一性别，大鼠8-12只/组；小鼠10-15只/组。至少设三个剂量组，同时设阴性对照组和模型对照组，必要时设溶剂对照组。每日经口灌胃给予受试样品，无法灌胃时将受试样品掺入饲料或饮水亦可，并记录每只动物的饲料摄入量或饮水量。原则上连续给予30天，必要时可延长至45天。模型组及各样品组于实验结束时一次尾静脉给予剂量为15～20mg/kg的刀豆蛋白A，小鼠10ml/kg BW，禁食8h后麻醉，腹主动脉采血，检测ALT、AST、LDH，并取肝组织，进行各项指标的检测及病理组织学检查。

2.3 结果判定

在模型成立的前提下，ALT、AST和LDH中任两项血液生化指标阳性和病理结果阳性，可判定受试样品对化学性肝损伤有辅助保护作用。

3. 方案二：酒精性肝损伤模型

动物实验分为急性酒精性肝损伤模型和亚急性酒精性肝损伤模型两种。

3.1急性酒精性肝损伤模型

3.1.1 原理：

机体大量摄入乙醇后，在乙醇脱氢酶的催化下大量脱氢氧化，使三羧酸循环和脂肪酸氧化减弱而影响脂肪代谢。乙醇通过增加甘油三酯合成，减少脂肪氧化，降低肝脏运出脂肪的功能，增加脂肪组织的脂肪动员,引起早期酒精性脂肪肝和高脂血症；此外乙醇能激活氧分子，产生氧自由基导致肝细胞线粒体脂质过氧化物形成及肝内还原型谷胱甘肽的耗竭。

3.1.2 试验方法

成年大鼠或小鼠，单一性别，大鼠8-12只/组；小鼠10-15只/组。至少设三个剂量组，同时设阴性对照组和模型对照组，必要时设溶剂对照组。每日经口灌胃给予受试样品，阴性对照组和模型对照组给予纯净水，1次/天，连续给予30天。将动物每周称重两次，按体重调整受试样品量。模型对照组和各样品组于实验结束时一次灌胃给予50%的乙醇，小鼠灌胃量12ml/kg BW，阴性对照组给予纯净水，禁食16h。动物腹腔注射60mg/kg BW的戊巴比妥钠溶液麻醉后腹主动脉采血检测血脂四项，并取肝组织检测MDA、GSH及病理组织学检查。

3.2 亚急性酒精性肝损伤模型

3.2.1 原理:

机体反复多次过量摄入乙醇后，乙醇可通过诱导CYP4502E1，引起氧化应激、脂质过氧化、代谢/营养的紊乱以及线粒体结构和功能的改变等一系列反应，导致肝细胞的功能损伤，进而引起肝组织中甘油三酯含量聚积，胆固醇合成加强，并引起相应载脂蛋白含量的改变。

3.2.2 试验方法

成年大鼠或小鼠，单一性别，大鼠8-12只/组；小鼠10-15只/组。至少设三个剂量组，同时设阴性对照组和模型对照组，必要时设溶剂对照组。每日经口灌胃给予受试样品，阴性对照组和模型对照组给予纯净水，1天/次，连续30天。将动物每周称重两次，以调整受试样品剂量。模型组和样品组于实验结束前14天每天经口灌胃给予30%的乙醇，小鼠灌胃量10ml/kg BW（乙醇密度0.8g/ml，折合乙醇的剂量为2400mg/kgBW）。样品灌胃后间隔4小时以上再给予乙醇。实验结束前禁食4h，麻醉，腹主动脉采血检测血脂四项，并取肝组织进行病理组织学检查。

4. 结果判定

急性酒精性肝损伤模型：①肝脏MDA、还原型GSH和TG三项检测指标结果阳性，同时病理组织学检查结果阳性，可判定受试样品对急性酒精性肝损伤有辅助保护作用；②血清中TG、VLDL-C两项指标阳性和病理组织学检查结果阳性，可判定该受试样品具有对急性酒精性肝损伤有辅助保护功能作用。

    亚急性酒精性肝损伤模型：①血清中TC、LDL-C和TBIL三项检测指标结果阳性，可判定该受试样品具有对亚急性酒精性肝损伤有辅助保护功能作用；②血清中TC和肝脏病理组织学检查结果阳性的前提下，同时血清中LDL-C和TBIL任一项检测指标结果阳性，可判定该受试样品具有对亚急性酒精性肝损伤有辅助保护功能作用。

    在急性或亚急性酒精性肝损伤结果判定中，任何一项结果为阳性时，可认为该受试物具有降低酒精性肝损伤危害的作用。