抗流感病毒药

 

    抗流感病毒药的药效学研究需要根据实验病毒感染细胞和模拟模型的致病特点和药物特性，进行药效实验。除药物实验用3个 剂量组，应设感染或模拟感染对照，药物对照和正常对照组，并同时进行病毒毒力测定，所得数据，实验组分别与对照组比较，判断效果，并计算所用病毒感染量IC50及ID50。

一、体外细胞培养试验：

1.病毒：选用流感病毒甲型HIN1，H2N2，H3N2及乙型，丁型标准毒株和临床分离甲，乙型病毒株，分别收取感染鸡胚尿囊液，-70℃保存。

2.细胞：狗肾传代细胞（MDCK）。

3.阳性药物对照：抗流感甲型，乙型病毒临床有效药物病毒唑。

4.病毒毒力测定： MDCK细胞96孔塑胶板单层培养，加入各病毒系列10倍稀释液，37℃ 5%C0₂培养3天观察细胞病变（CPE），测定各病毒半数致细胞病变剂量（TCID50）或空斑数PFU/ml。

5.药物毒性测定：MDCK细胞培养板，加入5倍或10倍稀释药液5-7个浓度， 37℃ 5%C0₂培养，观察细胞病变，或测定中性红染色OD值，计算药物致细胞毒性，计算最大无毒浓度（TCO）和半数中毒浓度（TC₅₀）。

6.抗病毒实验：

（1） 细胞病变抑制法：

MDCK细胞96孔培养板，加入100TCID50病毒液， 37℃ 5%CO₂吸咐2小时，吸去病毒，加入最大无毒浓度药液2倍稀释液7个浓度（1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64，1/128）37℃ 5%C0₂培养3天，观察细胞病变，记录病变程度。第5-7天倾去培养液，加入中性红染色，酶标仪测定OD。设病毒对照（不加药液），细胞对照（不加病毒），药物对照（细胞不加病毒，加不同浓度药液），与实验组同时观察CPE和中性红染色OD值，计算50%抑制病毒病变浓度（1C₅₀）及治疗指数（TI）。

（2）空斑抑制法：

24孔培养板上培养MDCK细胞，加入30-40 PFU/0.1ml病毒液，37℃ 5%CO₂吸时2小时，吸去病毒，用维持液洗2次，加40℃融化含不同浓度药液琼脂糖上层，37℃ 5%CO₂培养，设病毒，细胞和药物对照同上。3-4天后，当病毒对照出现空斑时，培养板细胞加福尔马林固定，结晶紫溶液染色，计数空斑，与病毒对照比较，计算50%抑制浓度1C₅₀，毒性TC₅₀和治疗指数。

二、小鼠体内试验：

流感病毒肺炎试验：

1.病毒：流感病毒A1型（HIN1）鼠肺适应株FM1感染鼠肺悬液接种鸡胚囊腔，收取尿囊液，-70℃保存，作毒种，或用病人分离的病毒作毒种。

2.小鼠：昆明或NIH，18-20g，雌雄分别分组。

3.阳性对照药：病毒唑。

4.抗病毒实验：病毒毒力测定：乙酵麻醉小鼠，滴鼻感染，每鼻孔不同稀释度病毒0.03ml计录死亡%计算LD₅₀。

5.药物毒性测定：小鼠急性毒性和亚急性毒性，计算LD₅₀及LD_O。

6.抗病毒试验：

小鼠滴鼻感染10 LD₅₀病毒量，2-24小时后开始口服或注射给药6天，记录死亡数和平均生存时间，观察2周，另组感染给药后第4-5天杀剖小鼠，计算肺病变程度及指数。与对照组比较死亡保护%，肺病变减轻%和延长生命%。作统计学处理，计算x值或1值和p值。如用病人分离的毒种，感染后不致发病死亡，杀剖实验及对照组鼠，取鼠肺在细胞培养内测定病毒。